KRAS基因及其靶向治疗的展望

2020-07-12

什么是KRAS基因

KRAS基因的全名叫Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog,翻成中文是“Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物”。KARS基因编码的蛋白是一种小GTP酶(smallGTPase),它属于RAS超蛋白家族,ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种—H-ras、K-ras和N-ras,分别定位在11、12和1号染色体上。KRAS蛋白质有188个氨基酸,它的分子量是21.6KD。在人的基因组中,有2个KRAS基因。一个是KRAS1,位于第6号染色体的短臂上;另一个是KRAS2,位于第12号染色体的短臂上。其中,KRAS1是“假基因”,不能被转录成RNA,所以它是没有功能的。而KRAS2才是“真基因”,能够转录、并且翻译成蛋白,具有生物学活性。(1)

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KRAS基因的信号转导

KRAS是一线传感器之一,可启动一系列信号分子的激活,使转导信号从细胞表面传递到细胞核,并影响一系列基本细胞过程,例如细胞分化、生长、趋化性和细胞凋亡。除了上述GTP/GDP结合之外,KRAS信号的激活现在被称为多步过程,需要适当的KRAS后翻译,质膜定位以及与效应蛋白的相互作用。这些机制的见解为探索KRAS信号靶向疗法铺平了道路。

新合成的KRAS是胞质和非活性蛋白。一系列的翻译后修饰发生在C末端CAAX(C,半胱氨酸;A,脂族氨基酸;X,末端氨基酸)四肽基序列上,从而使KRAS膜结合。下一步是通过RAS转换酶1(RCE1)进行蛋白水解去除,这发生在内质网的胞质表面。之后,异戊二烯半胱氨酸羧基甲基转移酶(ICMT)催化甲基转移至C端氨基酸,以消除负电荷并防止质膜排斥。另外,剪接变体KRAS-4A通过棕榈酰转移酶进行另外的棕榈酰化,导致KRAS-4A适当地靶向与膜结合。然而,主要的剪接变体KRAS-4B没有可检测的棕榈酰化,其可能通过微管依赖性机制到达质膜。KRAS蛋白的信号转导并不仅仅发生在质膜上,KRAS对下游信号通路的激活也可以由亚细胞区室(例如内质网和高尔基体)发出的信号触发。

响应细胞外刺激,从无活性的RAS-GDP转化为有活性的RAS-GTP进一步促进了各种信号转导的激活,包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,磷酸肌醇3激酶(PI3K)通路和Ral–GEFs通路,其中MAPK通路的特征最为明显。众所周知,RAS-GTP直接与RAF蛋白结合,从细胞质到细胞膜募集RAF激酶家族,它们在其中二聚并变得活跃。活化的RAF随后对其下游底物即MEK和ERK进行一系列的磷酸化反应,并传播生长信号。(2)

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肿瘤中的KRAS基因突变

RAS家族(KRAS、NRAS、HRAS)是人类癌症中最常见的致癌原因之一,但RAS基因突变的频率和分布是并不统一,其中KRAS最易突变,约占RAS突变的86%。在不同的癌种中的KRAS突变频率也有很大的差异,如在胰腺癌中突变频率达到90%,结肠癌30%到40%。肺癌为15%到20%(主要是非小细胞肺癌NSCLC),同时在其他的癌种中也有分布(3)。

具体见下图:

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在KRAS基因中最常见的突变主要发生在12、13或61号密码子上。KRAS突变也发生在63、117、119和146号密码子中,但频率较低。甘氨酸 12(G12)的突变通过干扰GAP结合和GAP刺激的GTP 引起RAS激活。水解。残基13处的突变与精氨酸发生空间碰撞,并降低GAP结合和水解。相反,谷氨酰胺 61帮助稳定水解反应的过渡态而在催化中具有直接作用。由于GTP酶活性降低的结果,KRAS 的核苷酸状态变得更加依赖于相关核苷酸的亲和力和浓度。这使GTP具有优于GDP 的优势,并增加了与GTP绑定的活动RAS的比例,从而导致激活状态的持续。此外,据报道残基12、13和61处的突变也降低了对RAF的RAS结合域(RBD)的亲和力,但程度不同。(4)



KRAS,不可成药靶点?

目前KRAS基因上的致癌突变十分清楚,那么,为什么到现在为止,仍未上市一个直接针对KRAS基因的靶向药物?原因在于KRAS蛋白是一种无特征、近乎球形的结构,无明显结合位点,很难合成一种能靶向结合并抑制其活性的化合物。长期以来无法攻克,KRAS已成为肿瘤药研发领域"不可成药"靶标的代名词。

困难点在于:

01、 KRAS的作用泛围很广,KRAS的正常活性也是许多正常细胞功能所需要的活性,如选取直接抑制KRAS的药物,则该药物毒性可能会很大,副作用也可能会很强。且KRAS与NRAS、HRAS有很高的同源性,能抑制KRAS活性的药物,就很可能会抑制NRAS、HRAS的活性。那么,这个药物的毒性就可能很大。

02、目前已知的KRAS的活性功能域,主要是KRAS与GDP、或GTP结合的口袋状的功能域。与蛋白激酶与ATP的亲和力较弱不同, KRAS与GTP、或GDP的结合非常强,亲合系数达到PicoMolar(皮摩尔浓度,10^-12)级。而正常细胞里面的GDP与GTP的浓度,达到了MicroMolar(微摩尔浓度,10^-6)级。所以,细胞内正常的GDP与GTP的浓度,比与KRAS结合所需的浓度,高了10的6次方倍。而RAS缺乏足够大的能够结合小分子的口袋;故要做出一种小分子化合物,其与KRAS的结合能力,要能与GDP、或者GTP相匹敌,非常难。

03、设计一种只针对性抑制突变KRAS蛋白的活性药物,而尽量少影响正常KRAS蛋白的活性,需要此种化合物对突变的KRAS有很好的选择性。这是药物设计的又一个难题。

04、然而,间接靶向KRAS的策略也是困难重重,包括阻断KRAS细胞膜定位和靶向KRAS下游的信号分子,如RAF、MEK、ERK和PI3K等家族成员。具体而言,间接途径的困难包括:

(1)RAS是正常细胞生长和存活相关的必需途径,靶向必需途径首先面临严重的毒副作用,导致疗效指数非常狭窄甚至没有;

(2)补偿逃逸机制;

(3)由于严格调节导致的信号反馈和冗余。

综上,就是到目前为何没有直接针对KRAS的靶向药物上市的主要原因。

而在2019年,针对KRAS这一靶点的抑制剂AMG510终于攻破了这一堡垒,让“不可成药”的魔咒将成为历史。这款有望攻克KRAS的抗癌新星已经来到中国,即将正式开展临床试验。

2019年3月9日,CDE(国家药监局药品审评中心)官网公布,安进公司研发的KRAS G12C抑制剂AMG 510准备在中国申请临床试验。在2020年,FDA授予了安进公司的靶向KRAS-G12C突变非小细胞肺癌患者的抑制剂AMG510快速通道,临床试验已在眼前。

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实际上关于AGM510作为KRAS(G12C)抑制剂首例药物对于癌症突出的治疗效果,早在2019年6月初的美国临床肿瘤学会(ASCO)上,安进公司就已经公布了该药的Ⅰ期临床结果,Ⅰ期临床研究(NCT03600883),29例KRAS(G12C)突变实体瘤可供评估,其中10例为非小细胞型肺癌,19例肠癌等实体瘤。10例非小细胞型肺癌中有5例癌肿缩小,4例无明显进展,仅有1例患者出现癌肿持续恶化。癌肿缩小的患者至学会发言时止仍在继续服药中(7.3-27.4周)。在其余实体瘤中反应一般,所有患者未表现有癌肿减小,仅有74%的患者表现为未进一步恶化。

另一方面AMG 510耐受性表现较好,主要不良反应为食欲下降、腹泻、乏力、头痛、咳嗽、潮热和恶心,没有发现剂量限制毒性和与药物有关的4级以上不良反应。


KRAS基因与靶向治疗

01、肺癌:由于KRAS位于EGFR受体的下游,因此KRAS突变会使EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的治疗效果降低,前瞻研究表明KRAS突变可以作为EGFR-TKIs治疗反应的不良预测分子标志物。

02、结直肠癌:如果存在RAS家族突变,患者会对西妥昔单抗或者帕尼单抗整体疗效产生负面影响,所以在使用药物前需进行KRAS、NRAS、BRAF的检测,从而实现精准用药。


派森诺医学肿瘤检测产品指导相关的靶向用药

目前,派森诺医学基于NGS平台(Illumina)和自主研发的高效率杂交捕获技术开发出一系列临床精准用药基因检测产品,从而进行KRAS用药检测,具体如下:

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(1)wikopedia KRAS ;https://en.wikipedia.org/wiki/KRAS

(2)Pingyu、Yijun Wang、Xin Li,Targeting the untargetable KRAS in cancer therapy; Acta Pharmaceutica Sinica B olume 9, Issue 5, September 2019, Pages 871-879.

(3)H. Singh, D.L. Longo, B.A. Chabner,Improving prospects for targeting RAS;J Clin Oncol, 33 (2015), pp. 3650-3659

(4)J.M. Ostrem, K.M. Shokat;Direct small-molecule inhibitors of KRAS: from structural insights to mechanism-based design,Nat Rev Drug Discov, 15 (2016), pp. 771-785



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